INTRODUCCIÓN

Los diferentes antígenos y anticuerpos detectables en el suero de los individuos infectados por el virus de la hepatitis B (VHB), constituyen marcadores serológicos indispensables para el diagnóstico y el seguimiento del curso clínico de la enfermedad (1,2,3).

Los anticuerpos desarrollados contra el antígeno core del virus de la hepatitis B (anti-HBcAg) son los primeros anticuerpos en aparecer después de la infección y son generalmente detectables al presentarse la enfermedad clínica (4,5).

Los anti-HBcAg tipo IgM pueden ser determinados tempranamente (de 12 a 20 semanas) en la sangre de los pacientes infectados después de la exposición al virus, y la presencia de este marcador en el suero en presencia de anticuerpos al HBc totales, es un indicador de diagnóstico de laboratorio de la fase aguda de la infección por el virus de la hepatitis B. La ausencia de anti-HBc de tipo IgM en presencia de anti-HBc total, es un indicador de recuperación de la infección por el VHB. Posteriormente se requiere del seguimiento del paciente a través de pruebas serológicas de otros marcadores del VHB, para definir el estado especifico de la infección.

Por otra parte permite detectar el estado de la infección en el cual el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) y los anticuerpos dirigidos contra estos (anti-HBsAg), no son detectables (período de ventana inmunológica) (7,8,9).

Los anticuerpos detectados pueden resultar un marcador útil en la fase crónica de la infección por el VHB cuando se detectan valores elevados de IgM, que son indicativos de la existencia de replicación viral y están siempre asociados al daño hepático producido por el virus, tanto en la fase aguda, como crónica de la enfermedad (8,9).

FUNDAMENTO DEL ENSAYO

El UMELISA ANTI-HBc IgM es un ensayo inmunoenzimático heterogéneo en su variante de captura, en el cual la fase sólida está constituida por tiras de ultramicroELISA (10 µL por pocillo) revestidas con anti-IgM humana. Las muestras se incuban en los pocillos y si éstas contienen anticuerpos IgM específicos se fijarán a la anti-IgM humana del recubrimiento. A continuación, previo lavado que elimina los componentes no fijados, se añade el antígeno (HBcAg) obtenido por vía recombinante seguido nuevamente de incubación y lavado. Posteriormente se añade un anticuerpo policlonal obtenido en conejo contra el antígeno core del virus de la hepatitis B conjugado con Fosfatasa Alcalina (F.A.). En caso de reacción positiva este anticuerpo marcado se unirá al complejo formado previamente sobre la fase sólida. Un nuevo lavado eliminará entonces el conjugado en exceso.

Al añadir un sustrato fluorigénico (4-Metilumbeliferil fosfato), este será hidrolizado y la intensidad de la fluorescencia emitida permitirá detectar la presencia de anticuerpos IgM específicos contra el antígeno core del virus de la hepatitis B en la muestra.

CONTENIDO DEL ESTUCHE Y PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE TRABAJO

Código UM 2030 (192 pruebas)

Contenido:

 

Placa recubierta de 12 tiras x 8 pocillos 2

2

R1: Solución Tampón 2 x 25 mL

2 x 25 mL

R2: Suero de Carnero

2 x 22 mL

R3: Control Negativo

1 x 0,5 mL

R4: Control Positivo

1 x 0,5 mL

R5: Antígeno HBc

1 x 5 mL

R6: Conjugado

1 x 5 mL

R7: Sustrato

1 x 2 mL

R8: Tampón Sustrato

1 x 18 mL

El lote de las placas recubiertas se muestra en el borde de su envase primario, el cual está compuesto por cinco dígitos, los cuatro primeros representan la fecha de vencimiento de las placas y el quinto representa un indicador numérico interno del proceso de producción.

Todos los reactivos contienen azida sódica (0,2 g/L) como preservante.

Los controles resultaron ser negativos a las pruebas de detección de HBsAg, Anti-VIH 1+2, Anti-VHC y Sífilis. El Control Positivo puede presentar reactividad a las pruebas de detección de HBsAg.

Preparación de las soluciones de trabajo:

R1: Para una tira de reacción, diluya 1 mL de la solución R1 hasta un volumen de 25 mL con agua destilada. Mezcle suavemente para evitar la formación excesiva de espuma. Prepare sólo lo necesario para el ensayo.

R2: Diluya 1:10 con solución de trabajo R1. Cantidad necesaria por tira: 7 mL (0,7 mL de R2 + 6,3 mL de R1). Prepare sólo lo necesario para el ensayo.

R3: Listo para el uso.

R4: Diluya 1:101 con la solución de trabajo R2. Cantidad necesaria por tira 0,5 mL (5 m L de R4 + 0,5 mL de R2). Prepare solo lo necesario para el ensayo.

R5: Listo para el uso. Cantidad necesaria por tira: 0,2 mL.

R6: Listo para el uso. Cantidad necesaria por tira: 0,2 mL.

R7: Diluya 1:10 con R8. Cantidad necesaria por tira: 0,5 mL (0,05 mL de R7 + 0,45 mL de R8). Prepare inmediatamente antes de usar y sólo lo necesario para el ensayo.

 

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

Todos los reactivos deben mantenerse de 2 a 8 ºC. En estas condiciones, serán estables en el envase original hasta la fecha de vencimiento.

Después de utilizar parte del contenido de los reactivos, el resto es estable durante dos meses si se mantienen las mismas condiciones de almacenamiento y se evita la contaminación durante la ejecución de la prueba.

Las tiras de reacción no utilizadas se mantienen estables durante dos meses de 2 a 8 ºC en la bolsa suministrada, protegida con el desecante y herméticamente cerrada. 

MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS

- Agua destilada.

- Papel absorbente.

- Hipoclorito de Sodio.

- Pipeta multicanal con puntas desechables para 10 µL.

- Pipetas de precisión entre 5 y 1000 µL.

- Probetas graduadas entre 10 y 250 mL.

- Incubadora a 37 ± 1 ºC.

PRECAUCIONES

-Antes de comenzar a trabajar verifique que todos los reactivos estén completamente homogéneos y a temperatura ambiente.

-Manipule las muestras y los controles como potencialmente infecciosos. Utilice guantes desechables. Los materiales utilizados deben colocarse en soluciones desinfectantes (Hipoclorito de sodio al 5 %) o esterilizarse en autoclave.

-Considere a los equipos y accesorios que han estado en contacto directo con las muestras como contaminados. Realice los procedimientos de limpieza que se recomiendan en los manuales de usuario correspondientes.

-Las tiras de reacción deben estar a la temperatura del laboratorio antes de retirarles la cubierta protectora.

-Utilice puntas limpias o nuevas para el trabajo con las soluciones y las muestras.

-No incorpore a los frascos originales remanentes de reactivos.

-Los sueros y plasmas a utilizar deben ser preferentemente frescos, no inactivados por calor y sin precipitados. Evite la congelación y descongelación reiterada de las muestras.

-Verifique que las tiras de reacción estén bien niveladas en el soporte.

-Evite posibles contaminaciones con materiales fluorescentes.

-Verifique periódicamente la exactitud y precisión de las pipetas.

-Cumpla las normas de manipulación de los equipos utilizados y verifique previamente su adecuado funcionamiento, tenga especial cuidado en las operaciones de pipeteo y lavado.

-Si utiliza la multipipeta ERIZO para transferir las muestras y los controles, debe lavar profusamente sus puntas para evitar la contaminación, al menos un lavado de 5 ciclos con solución de trabajo R1 y un lavado de 5 ciclos con agua destilada. Deseche la solución y el agua destilada después de cada lavado.

- Siga cuidadosamente las instrucciones de utilización del equipo de lavado. Los lavados incompletos influyen negativamente en el resultado del ensayo.

-Evite la exposición a la luz de los frascos que contienen el sustrato.

-El juego de reactivos no debe emplearse después de la fecha de vencimiento.

-Los reactivos del UMELISA ANTI-HBc IgM de lotes diferentes no se deben intercambiar.

 

PROCEDIMIENTO TÉCNICO

1.- Preparación de las muestras y controles.

El control negativo se presenta en el estuche listo para usar.

El control positivo necesita de una previa dilución 1: 101 antes de su uso en el ensayo (Ver Preparación de las soluciones de trabajo). No utilice la dilución 1:101 del Control Positivo después de 12 horas de ser preparada.

Diluya las muestras a analizar 1:5151 en 2 pasos:

Dilución 1: 5 µL de muestra 500 µL de la solución de trabajo R2

Dilución 2: 5 µL de la dilución 1 + 250 µL de la solución de trabajo R2.

 

2.- Adición de las muestras y controles a las tiras de reacción.

Coloque 10 µL de las muestras previamente diluidas ( dilución 2 ) y de los controles sobre los pocillos de reacción, de acuerdo con el siguiente esquema de distribución:

El Control Positivo (P) (dilución 1:101) y el Control Negativo (N) deben añadirse de forma manual con una pipeta de precisión. Como Blanco (B) utilice la solución R2 de trabajo.

Se recomienda evaluar las muestras por duplicado . Si utiliza el programa UMELISA ANTI-HBc IgM para la interpretación automática de los resultados, debe colocar en las posiciones 1 y 2 la primera muestra, en las posiciones 3 y 4 la segunda y así sucesivamente.

3.- Incubación de las muestras y controles.

Incube las tiras durante 1 hora a 37 ºC en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura.

4.- Lavado.

Utilice un lavador de la tecnología SUMA. Lave las tiras de reacción cuatro veces. Verifique el llenado total del pocillo con la solución R1 de trabajo. La solución debe permanecer como mínimo 30 segundos en los pocillos en cada lavado. Después de la última aspiración seque las tiras sobre papel absorbente.

5.-Adición de la solución HBcAg.

Añada 10 µL de la solución en cada pocillo de reacción empleando una punta preferiblemente nueva o sólo destinada para este uso.

6.- Incubación de la solución HBcAg.

Incube las tiras de reacción 2 horas a 37 ºC en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura.

7.- Lavado.

Lave las tiras de reacción según se describe en el acápite 4.

8.- Adición del conjugado.

Con una punta nueva extraiga del frasco de conjugado la cantidad necesaria a emplear según el número de tiras del ensayo y deposítelo en un recipiente limpio. Añada 10 µL del conjugado en cada pocillo de reacción.

9.- Incubación del conjugado.

Incube las tiras de reacción 1 hora a 37 ºC en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura.

10.- Lavado.

Lave las tiras de reacción según se describe en el acápite 4.

11.- Adición del sustrato.

Coloque 10 µL de sustrato convenientemente diluido en cada pocillo de las tiras de reacción.

12.- Incubación del sustrato.

Incube 30 minutos en cámara húmeda a temperatura ambiente (20 - 25 ºC). En estas condiciones se garantiza una señal de fluorescencia del Control Positivo entre 90 y 180 unidades. Sin embargo, debido a las variaciones de temperatura se recomienda que cada laboratorio establezca su propio tiempo de incubación óptimo.

13- Lectura.

Realice la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida en cada determinación utilizando un lector de la serie SUMA.

La validación, interpretación de resultados y su impresión, son efectuadas automáticamente por el lector SUMA con el programa UMELISA ANTI-HBc IgM o pueden hacerse manualmente por el operador siguiendo las instrucciones que se describen a continuación.

 

CONTROL DE LA CALIDAD

Las condiciones mínimas requeridas para asegurar la calidad del ensayo son las siguientes:

a) Al menos uno de los duplicados del Blanco (B1 o B2) debe tener un valor de fluorescencia menor de 10 unidades.

b) Al menos uno de los duplicados del Control Negativo (N1 o N2) debe presentar una fluorescencia que no supere en más de 10 unidades a la media del Blanco.

c) Al menos uno de los duplicados del Control Positivo (P1 o P2) debe tener un valor de fluorescencia entre 90 y 180 unidades.

d) (NN - BB)/ (P - BB) £ 0,1 Donde:

NN: Valor promedio del Control Negativo.

BB: Valor promedio del Blanco.

P: Si ambos duplicados están dentro del rango de aceptación y la diferencia de los duplicados entre su valor promedio (CD) es menor del 20 %, P se corresponde con la media de los valores de fluorescencia del control positivo. Si CD es mayor del 20 %, P se corresponde con el menor valor de fluorescencia. 

NIVEL DE CORTE

Las muestras de suero o plasma se consideran positivas cuando:

(Fi-BB)/(P-BB) ³ 0,5

Fi = Fluorescencia de la muestra.

Para definir de una forma rápida el nivel de corte y nivel de BL cuando no se dispone del programa automático, se calcula de la siguiente forma:

0,500 (P-BB) + BB

0,450 (P-BB) + BB

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

I- Muestras analizadas por duplicado.

La interpretación de los resultados se realizará según el siguiente diagrama:


II- Muestras analizadas de forma simple:

- Si se obtienen valores menores que el nivel de corte la muestra se considera no reactiva.

- Si una muestra presenta valores mayores o iguales que el nivel de corte, se considera reactiva ("POSITIVO") .

Se recomienda que toda muestra con resultado ("POSITIVO") se repita antes de realizar una interpretación, utilizando la fuente original.

 

CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DEL ENSAYO

DETECTABILIDAD.

Se determinó con una preparación estándar anti-HBc IgM del Instituto Paul Ehrlich (Alemania) y fue de 50 UPEI/mL.


SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD.

Fue calculada utilizando un panel de 597 muestras procedentes de donantes de sangre sanos y pacientes infectados con HBV, clasificadas por otras técnicas inmunoenzimáticas comerciales.

Muestras Analizadas

 

VP

 

FN

 

VN

 

FP

Sensibilidad (%)

Especificidad (%)

 

597

 

200

 

1

 

390

 

6

 

99,5

 

98,5

VP: Verdaderos Positivos. VN: Verdaderos Negativos.

FP: Falsos Positivos. FN: Falsos Negativos.

 

PRECISIÓN:

Durante tres días se estudiaron tres muestras, el control positivo y el control negativo del estuche, analizando cinco replicados cada día, utilizando los mismos lotes de reactivos. Se calculó la desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación intra e interensayo para los valores de fluorescencia.

 
Precisión del UMELISA ANTI-HBc IgM

Muestras

Media (U.F.)

Intraensayo (n=10)

Interensayo (n=30)

 
   

CV (%)

CV (%)

N

5,6

7,1

10

P

147,6

3

3,7

M1

8,9

6,9

9,9

M2

40,8

5,6

7,9

M3

119,7

4,9

5,3

U.F: Unidades de Fluorescencia. CV : Coeficiente de Variación

REACTIVIDAD CRUZADA:

Se evaluaron un total de 41 muestras Factor Reumatoideo positivas (RF+) y 64 muestras que resultaron positivas en su evaluación por el ensayo UMELISA DENGUE IgM, lo cual podría ser un indicador de interferencia para los ensayos de detección de anticuerpos de clase IgM. Las muestras positivas por el UMELISA ANTI-HBc IgM fueron confirmadas por el ensayo HEPANOSTIKA ANTI-HBc IgM.

Grupo

n

UMELISA ANTI-HBc IgM

positiva

Porcentaje de reactividad

confirmada

DENGUE IgM positiva

64

0

0 %

Factor Reumatoideo positiva

41

2

0 % (0/2)

 


BIBLIOGRAFÍA

1-Benhamov, J.P.: Viral Hepatitis an overview (A,B,C,D,E). En: Viral Hepatitis Management. Standards for the future. Abstract & Posters. Cannes, 1992. p.6.

2-Perrillo, R.P.: Hepatitis B: Transmission and Natural History. En: Viral Hepatitis Management. Standards for the future. Abstract & Posters. Cannes, 1992. p.15.

3-Chang, M.H.et al.: Hepatitis B virus integration in hepatitis B virus related hepatocellular carcinoma in childhood. Hepatology. 13:316, 1991

4-Trepo, C.: Diagnostic Markers of Viral Hepatitis B and C. En: Viral Hepatitis Management. Standards for the future. Abstract & Posters. Cannes, 1992. p.21.

5-Margolis, H.S.et al.: Hepatitis B: Evolving epidemiology and implications for control. Sem. Liver Dis. 11:84-92, 1991.

6-Alter, M.J.et al.: Importance of heterosexual activity in the transmission of hepatitis B and non-A, non-B hepatitis. JAMA 262:1201, 1989.

7-Ko, Y.C. et al.: Horizontal transmission of hepatitis B virus from siblings and intramuscular infection among preschool children in a familiar cohort. Am.J.Epidemiol. 133:1015, 1991.

8-Gilson RJC. Sexually Transmitted Hepatitis: A Review. Genitourin Med 1992;68: 123-129.

9-Padrón, G.J. et al: Bases Moleculares para el estudio de la hepatitis virales. Elfos Scientiae. 136, 1998.

 

Octubre 21, 2004

UMELISA ANTI-HBc IgM

CODIGO UM 2030

Centro de Inmunoensayo. Calle 134 y Ave.25. Apdo. Postal 6653, La Habana, CUBA. Teléfono: 208-2929. Fax: (537) 208-6514.