INTERÉS CLÍNICO

El dengue es una enfermedad viral aguda transmitida por mosquitos (1) del género Aedes (fundamentalmente el Aedes aegypti y el Aedes albopictus ). La misma se caracteriza por fiebre, dolor de cabeza, artralgia, rash, náuseas y vómitos. Algunas de estas infecciones derivan en la fiebre hemorrágica del dengue (FHD), una de las formas graves de la enfermedad, la cual se asocia a alteraciones de la permeabilidad vascular (2) y en algunos casos de FHD se producen complicaciones severas que conducen al llamado síndrome de choque por dengue (SCD) (3).

En los últimos años, la fiebre del dengue, ha re-emergido acompañada de una amplia distribución geográfica tanto del virus como del mosquito (4), una incrementada actividad epidémica, el desarrollo de hiper-endemicidad o lo que es lo mismo la co-circulación de los diferentes serotipos (5) y la aparición de la enfermedad en nuevas zonas geográficas. En 1998 fue la enfermedad infecciosa tropical más importante, seguida de la malaria, con un estimado de 100 millones de casos, 500 000 de fiebre hemorrágica de dengue y 25 000 muertes (6).

En la actualidad se conoce que la detección de anticuerpos IgM específicos contra el virus dengue indica infección activa o reciente (7,8). Esta clase de anticuerpos se desarrolla tempranamente y de forma general se pueden detectar a partir del quinto día de comienzo de los síntomas y como promedio disminuyen a partir de los 30 días (9), aunque pueden detectarse hasta los 60 días o más, es por ello que la fiebre de dengue es usualmente diagnosticada con el empleo de ELISA tipo captura para la detección de anticuerpos IgM anti dengue (10).

El UMELISA DENGUE IgM PLUS, concebido para la detección de anticuerpos IgM dirigidos contra los cuatro serotipos del virus dengue en muestras de suero humano y sangre seca sobre papel de filtro, es un ensayo inmunoenzimático de gran utilidad, tanto en el diagnóstico de casos clínicamente sospechosos, como en los sistemas de vigilancia epidemiológica de esta enfermedad.

FUNDAMENTO DEL ENSAYO

El UMELISA DENGUE IgM PLUS es un ensayo inmunoenzimático heterogéneo en su variante captura que emplea las ventajas de la reacción de alta afinidad entre la Estreptavidina y la Biotina y donde se utilizan como fase sólida tiras de ultramicroELISA (10 microlitros por pocillo) revestidas con anti IgM humana.

Las muestras se incuban en los pocillos de las tiras y los anticuerpos en su superficie capturan la IgM presente en el suero. A continuación, previo lavado que elimina los componentes de la muestra no fijados, se añade el antígeno de dengue (mezcla de los 4 serotipos del virus) que se unirá a la IgM específica capturada en el paso anterior.

Una vez eliminado el antígeno en exceso, se añaden anticuerpos monoclonales biotinilados específicos al virus dengue (Anticuerpos Biotinilados), que se unirán al complejo formado sobre la fase sólida.

Luego de otro paso de incubación y lavado se aplica el conjugado Estreptavidina / Fosfatasa Alcalina (F.A.), que se unirá al complejo formado anteriormente en caso de reacción positiva. Un nuevo lavado de las tiras eliminará el conjugado en exceso. Por último, se adiciona el sustrato fluorigénico (4-Metilumbeliferil fosfato), que será hidrolizado y la intensidad de la fluorescencia emitida permitirá detectar en la muestra la presencia de anticuerpos IgM específicos al virus del dengue.

CONTENIDO DEL ESTUCHE Y PREPARACION DE LAS SOLUCIONES DE TRABAJO.

Código UM 2016 (288 pruebas)

Contenido:

Placa recubierta de 12 tiras x 8 pocillos

3

Reactivo 1 (R1): Solución Tampón

2 x 25 mL

Reactivo 2 (R2): Suero de Carnero

1 x 18 mL

Reactivo 3 (R3): Control Negativo

1 x 0,5 mL

Reactivo 4 (R4): Control Positivo

1 x 0,5 mL

Reactivo 5 (R5): Antígeno Dengue

3 x Liofilizado

Reactivo 6 (R6): Anticuerpos Biotinilados

1 x 7,5 mL

Reactivo 7 (R7): Conjugado

1 x 7,5 Ml

Reactivo 8 (R8): Sustrato

1 x 2 mL

Reactivo 9 (R9): Tampón Sustrato

1 x 18 mL

El lote de las placas recubiertas se muestra en el borde de su envase primario, el cual está compuesto por cinco dígitos, los cuatro primeros representan la fecha de vencimiento de las placas y el quinto representa un indicador numérico interno del proceso de producción.

Todos los reactivos contienen azida sódica (0,2 g/L) como preservante.

Los controles resultaron negativos a las pruebas de detección de Anti-VIH 1+2, HBsAg, Anti-VHC y Sífilis. El Control Positivo ha sido inactivado por tratamiento térmico.

 

Preparación de las soluciones de trabajo:

R1: Para una tira de reacción, diluya 1 mL de la solución R1 hasta un volumen de 25 mL con agua destilada. Mezcle suavemente para evitar la formación excesiva de espuma. Prepare sólo lo necesario para el ensayo.

R2: Diluya 1:4 con solución de trabajo R1. Cantidad necesaria por tira: 2 mL (0,5 mL de R2 + 1,5 mL de R1). Prepare sólo lo necesario para el ensayo.

R3: Listo para usar.

R4: Listo para usar.

R5: Reconstituya con 2 mL de solución de trabajo R2. Cantidad necesaria por tira: 0,2 mL.

R6: Listo para usar. Cantidad necesaria por tira: 0,2 mL.

R7: Listo para usar. Cantidad necesaria por tira: 0,2 mL.

R8: Diluya 1:10 con R9. Cantidad necesaria por tira: 0,5 mL (0,05 mL de R8 + 0,45 mL de R9). Prepare inmediatamente antes de usar y sólo lo necesario para el ensayo.

 

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

Todos los reactivos deben mantenerse de 2 a 8 °C . En estas condiciones, serán estables en el envase original hasta la fecha de vencimiento.

Después de utilizar parte del contenido de los reactivos, el resto es estable durante dos meses si se mantienen las mismas condiciones de almacenamiento y se evita la contaminación durante la ejecución de la prueba.

Las tiras de reacción no utilizadas se mantienen estables durante dos meses de 2 a 8 °C en la bolsa suministrada, protegida con el desecante y herméticamente cerrada.

El antígeno una vez reconstituido es estable durante 30 días y debe conservarse de 2 a 8 °C ó a -20 °C.

MATERIALES NECESARIOS NO SUMINISTRADOS

- Agua destilada.

- Papel absorbente.

- Hipoclorito de Sodio.

- Pipeta multicanal con puntas desechables para 10 µL.

- Pipetas de precisión entre 5 y 1000 µL.

- Probetas graduadas entre 10 y 250 mL.

- Incubadora a 37 ± 1 °C.

PRECAUCIONES

- Los sueros a utilizar deben ser preferentemente frescos, no inactivados por calor y sin precipitados. Los sueros hemolíticos, lipémicos o contaminados por microorganismos pueden causar resultados erróneos en la prueba. Debe evitarse la congelación y descongelación reiterada de las muestras.

- Las muestras de sangre seca d eben ser colectadas en papel de filtro S&S 903 .

- Las muestras de sangre seca colectadas sobre papel de filtro S&S 903 , almacenadas de 2 a 8 °C o a –20 °C, son estables durante 12 meses. A temperaturas superiores a las mencionadas disminuye significativamente la estabilidad de este tipo de muestras.

- Para garantizar resultados confiables de la prueba, debe garantizar que las muestras hayan sido tomadas a partir del quinto día de comienzo de los síntomas.

- Antes de comenzar a trabajar verifique que todos los reactivos estén completamente homogéneos y a temperatura ambiente.

- Manipule las muestras y los controles como potencialmente infecciosos. Utilice guantes desechables. Los materiales utilizados deben colocarse en soluciones desinfectantes (Hipoclorito de sodio al 5%) o esterilizarse en autoclave.

- Considere a los equipos y accesorios que han estado en contacto directo con las muestras como contaminados. Realice los procedimientos de limpieza que se recomiendan en los manuales de usuario correspondientes.

- Las tiras de reacción deben estar a la temperatura del laboratorio antes de retirarles la cubierta protectora.

- Utilice puntas limpias o nuevas para la reconstitución y trabajo con las soluciones y las muestras.

- Después de incubar el Antígeno y realizar el lavado, proceda inmediatamente a la adición de los anticuerpos biotinilados, esto garantiza la estabilidad del Antígeno que se encuentra formando parte de la reacción inmunológica que ha ocurrido en la fase sólida.

- No incorpore a los frascos originales remanentes de reactivos.

- Verifique que todas las tiras de reacción estén bien niveladas en el soporte.

- Evite posibles contaminaciones con materiales fluorescentes.

- Verifique periódicamente la exactitud y precisión de las pipetas.

- Cumpla las normas de manipulación de los equipos utilizados y verifique su adecuado funcionamiento, tenga especial cuidado en las operaciones de pipeteo y lavado.

- Evite la exposición a la luz de los frascos que contienen el sustrato.

- El juego de reactivos no debe emplearse después de la fecha de vencimiento.

- Los reactivos de lotes diferentes no se deben intercambiar.

 

PROCEDIMIENTO TÉCNICO

1.- Preparación de las muestras y controles.

Los controles se presentan en el estuche listos para usar . La preparación de las muestras varía según se trate de muestras líquidas de suero o muestras de sangre seca sobre papel de filtro. En ambos casos deben cumplir el requisito de haber sido colectadas a partir del quinto día de comienzo de los síntomas.

Procedimiento A: Para muestra de suero. Diluya las muestras 1:21 con la solución de trabajo R2 (5 µL de suero + 100 µL de la solución).

Procedimiento B: Para muestras de sangre seca colectadas sobre papel de filtro S&S 903 . Corte con un perforador para papel un disco de 3 mm de diámetro en la zona central de la mancha de sangre. Deposítelo en un recipiente apropiado y añádale 40 m L de solución de trabajo R2. Incube una hora a temperatura ambiente (20-25 °C) en cámara húmeda. Homogeneice adecuadamente.

2.- Adición de las muestras y controles a la tira de reacción.

Colocar 10 µL de las muestras previamente diluidas y de los controles sobre los pocillos de reacción, de acuerdo con el siguiente esquema de trabajo:

El Control Positivo (P) y el Control Negativo (N) deben añadirse de forma manual con una pipeta de precisión y puntas independientes.

Se recomienda evaluar las muestras por duplicado . Si utiliza el programa UMELISA DENGUE IgM PLUS para la interpretación automática de los resultados, debe colocar en las posiciones 1 y 2 la primera muestra, en las posiciones 3 y 4 la segunda y así sucesivamente.

3.- Incubación de las muestras y controles.

Incube las tiras 30 minutos a 37 °C en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura.

4.- Lavado.

Lave las tiras de reacción cuatro veces. Verifique el llenado total del pocillo con la solución R1 de trabajo (25 µL). La solución debe permanecer como mínimo 30 segundos en los pocillos en cada lavado. Después de la última aspiración seque las tiras sobre papel absorbente.

5.- Adición del Antígeno.

Añada 10 µL del antígeno en cada pocillo de reacción empleando una punta preferiblemente nueva o sólo destinada para este uso.

6.- Incubación del Antígeno.

Incube las tiras 30 minutos a 37 °C en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura.

7.- Lavado.

Lave las tiras de reacción según se describe en el acápite 4 e inmediatamente proceda a añadir los anticuerpos biotinilados.

8.- Adición de los Anticuerpos Biotinilados.

Con una punta nueva extraiga del frasco de Anticuerpos Biotinilados la cantidad necesaria a emplear según el número de tiras del ensayo y deposítelo en un recipiente limpio. Añada 10 µL en cada pocillo de reacción.

9.- Incubación de los Anticuerpos Biotinilados.

Incube las tiras 30 minutos a 37 °C en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura.

10.- Lavado.

Lave las tiras de reacción según se describe en el acápite 4.

11.- Adición del Conjugado.

Con una punta nueva extraiga del frasco de conjugado la cantidad necesaria a emplear según el número de tiras del ensayo y deposítelo en un recipiente limpio. Añada 10 µL en cada pocillo de reacción.

12.- Incubación del Conjugado.

Incube las tiras 30 minutos a 37 °C en cámara húmeda previamente equilibrada a esa temperatura.

13.- Lavado.

Lave las tiras de reacción según se describe en el acápite 4.

14.- Adición del Sustrato.

Coloque 10 µL de sustrato convenientemente diluido en cada pocillo de la tira de reacción.

15.- Incubación del Sustrato.

Incube 30 minutos en cámara húmeda a temperatura ambiente (20 - 25 °C). En estas condiciones se garantiza una señal de fluorescencia del Control Positivo entre 75 y 180 unidades. Sin embargo, debido a las variaciones de temperatura se recomienda que cada laboratorio establezca su propio tiempo de incubación óptimo.

16- Lectura.

Realice la lectura de la intensidad de la fluorescencia emitida en cada determinación utilizando un lector de la serie SUMA.

La validación e interpretación de los resultados se realiza automáticamente por el programa UMELISA DENGUE IgM PLUS, o pueden calcularse manualmente de acuerdo a las instrucciones que se describen a continuación. 

CONTROL DE LA CALIDAD

Las condiciones mínimas requeridas para asegurar la calidad del ensayo son:

a) Al menos dos de los tres valores del Control Negativo deben presentar una fluorescencia menor que 12 unidades.

b) Al menos dos de los tres valores del Control Positivo deben presentar una fluorescencia entre 75 y 180 unidades.

c) (NN)/(P-NN) = 0,16 Donde:

NN: Mediana de la fluorescencia de los valores del Control Negativo que se encuentran dentro de los límites de calidad.

P: Mediana de la fluorescencia de los valores del Control Positivo que se encuentran dentro de los límites de calidad. Si dos de los tres valores del Control Positivo son los que se encuentran dentro de los límites de calidad, entonces P será la mediana de la fluorescencia de los mismos siempre que el coeficiente de dispersión entre ambos sea menor del 20 %. Si el coeficiente de dispersión entre estos valores es mayor del 20 %, entonces P es el menor valor de fluorescencia de los dos controles positivos que se encuentran dentro de los límites de calidad.

Corte

o

o


NIVEL DE CORTE

Las muestras de suero y sangre seca sobre papel de filtro se consideran positivas cuando:

(Fi-NN)/(P-NN) ³ 0,225

Fi = Fluorescencia de la muestra.

Las muestras se consideran en el umbral de positividad (BL) cuando sus resultados se encuentran en una zona comprendida entre el nivel de corte y un 15 % por debajo del mismo (“zona gris”).

Para definir de una forma rápida el nivel de corte y el límite inferior de la zona gris cuando no se dispone del programa automático, se calcula el valor de fluorescencia correspondiente para cada caso.

FNC = 0,225 (P-NN) + NN

FBL = 0,191 (P-NN) + NN

Donde:

FNC = Valor de fluorescencia correspondiente al nivel de corte.

FBL = Valor de fluorescencia correspondiente al límite inferior de la zona gris.

 

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

I- Muestras analizadas por duplicado.

La interpretación de los resultados se realizará según el siguiente diagrama:

II- Muestras analizadas de forma simple:

- Si se obtienen valores menores al límite inferior de la “zona gris” la muestra se considera no reactiva.

- Si una muestra presenta valores mayores o iguales que el nivel de corte, se considera reactiva ("POSITIVO") .

- Si una muestra se encuentra en la “zona gris“ (“BL”) se considera en el umbral de positividad.

Se recomienda que toda muestra con resultado ("POSITIVO") o (“BL”) se repita antes de realizar una interpretación definitiva , utilizando la fuente original.

Para aquellos casos que hayan resultado repetidamente BL, se recomienda tomar otra muestra, al menos siete días después de la primera, para establecer un diagnóstico más certero.

Las muestras que resulten repetidamente reactivas, tienen alta probabilidad de contener anticuerpos de la clase IgM específicos al virus dengue.

 

SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD

En 624 muestras de suero procedentes de individuos con síntomas de enfermedad eruptivo febril, colectadas durante epidemias de dengue, se obtuvo una sensibilidad de 97,27 % y una especificidad de 97,47 %, empleando para este estudio el ensayo de referencia MAC-ELISA Dengue del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” de Cuba.

En 1 416 muestras de donantes de sangre evaluadas, la especificidad de la prueba fue de 99,86 %, empleando como referencia el ensayo MAC-ELISA Dengue del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” de Cuba.

Como resultado de una validación externa realizada en el Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” de Cuba, empleando un panel de 451 muestras de suero, procedentes en su mayoría de la vigilancia epidemiológica del dengue que se lleva a cabo en Cuba y de las epidemias que afectaron diferentes zonas del país en 1997 y 2001, se obtuvo 99,4 % de sensibilidad y 94,8 % de especificidad.

Tanto la sensibilidad, como la especificidad de la prueba en muestras de sangre seca sobre papel de filtro fue del 100 % Para el estudio de estas características funcionales se analizaron los resultados de 619 muestras pareadas de suero y sangre seca: 468 procedentes de donantes de sangre y 151 colectadas durante la epidemia de dengue ocurrida en Honduras en julio de 2002. Los resultados de las muestras en suero fueron considerados como la referencia para el análisis

 


BIBLIOGRAFÍA

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•  Guzmán MG, Kourí G. Advances in dengue diagnosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3(6): 621-627, 1996.

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•  Organización Panamericana de la Salud. Dengue y dengue hemorrágico en las Américas: guías para su prevención y control. Publicación Científica Nº 548: 1-109, 1995.

10.Talarmin A. Labeau B. Lelarge J. Sarthou JL.: Immunoglobulin A-specific capture enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of dengue fever. Journal of Clinical Microbiology. 36(5):1189-1192, 1998 May.

 

 

 

Marzo 31, 2005

UMELISA DENGUE IgM PLUS

CODIGO UM 2016

Centro de Inmunoensayo. Calle 134 y Ave. 25, Apdo. postal 6653, La Habana, CUBA. Teléfono: 208-2929. Fax: (537) 208-6514.